Диагностика и выявление возбудителей инфекционных заболеваний. Начало
ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКА ЛЕГОЧНОЙ ИНФЕКЦИИ.
Бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ) является безопасным и неинвазивным методом диагностики легочной инфекции. Выявление патогенов в БАЛ позволяет не только подтвердить или опровергнуть наличие пневмонии, но и подобрать адекватную антибактериальную терапию. Для проведения рутинного бактериологического обследования БАЛ требуется, как правило, несколько суток. Тест с использованием акридин-оранжевого теста (АОТ) позволяет подтвердить или исключить наличие патогенов в БАЛ в течение 3-4 часов.Тест основан на феномене яркого свечения в ультрафиолетовых лучах нуклеиновых кислот бактерий - РНК и ДНК, практически равномерно распределенных в цитоплазме микробных клеток, что резко выделяет их на остальном клеточном фоне, который имеет более слабое свечение.
При проведении БАЛ бронхоскоп подводят к наиболее пораженному участку легкого (по данным рентгенографии и/ или компьютерной томографии) и выполняют заклинивания бронха. Объем вводимой лаважной жидкости у всех больных одинаков и составляет 160 мл дробно (8 раз по 20 мл). Последующее отсасывание лаважной жидкости проводят путем мягкого отсасывания с помощью шприца, присоединенного через трехходовой краник к стерильному пластиковому мешку. Часть полученной лаважной жидкости отделяют для посева на количественную культуру. Оставшуюся часть перемешивают и центрифугируют. Осадок ресупендируют и отмывают фосфатным буфером, а затем с помощью цито-центрифуги готовят цитопрепарат. Для АОТ стекла с монослоем клеток подсушивают на воздухе, покрывают на 2 мин тонким слоем 0,01 % раствором акридин-оранжевого в ацетатном буфере (рН 4), после чего избыток краски отмывают водой. После повторного просушивания препарат изучают в люминисцентном микроскопе. Обычные характеристики люминисцентного свечения: на темно-зеленом фоне, переходящем черный, бактерии и грибы дают яркое оранжевое свечение, фибрин - красновато-буро-оранжевое свечение. Метод позволяет дать ответ уже через 3-4 часа после проведения бронхоскопии. Считается, что у больного имеется пневмония, если количество инфицированных клеток, т.е. клеток, содержащих в своей цитоплазме микроорганизмы, превышает 5 % от всего количества клеток, просчитанных в полях зрения.
Применение акридин-оранжевого теста позволяет более быстро определять наличие микроорганизмов в бронхоальвеолярном лаваже.
ПРИБОР ДЛЯ КОНТРОЛЯ МИКРОБНОЙ ОБСЕМЕНЕННОСТИ.
До настоящего времени задачи по контролю микробной обсемененности в России и странах СНГ решаются в основном с использованием аппарата Кротова, выпуск которого был прекращен в 1980 году, т. е. измерения проводятся, как правило, выработавшими свой ресурс приборами или методом свободного осаждения микроорганизмов на чашки Петри. Еще реже используются современные импакторы зарубежного производства, которые имеют высокую стоимость. Разработан импактор "Флора-100" производства ГНЦ — Государственного НИИ биологического приборостроения, Москва (разработчики В.В. Буянов, В.А. Минаев, А.М. Демина, В.П. Никольская).Импактор представляет собой низконапорное аспирирующее устройство, прокачивающее через многосопловую (367 отверстий) решетку воздух с объемным расходом 200 л/мин. Содержащиеся в воздухе микроорганизмы за счет инерционных сил осаждаются на чашку Петри с плотной питательной средой. Скоростные потоки воздуха рассчитаны таким образом, что диаметр частиц, осаждающихся с эффективностью 50%, составляет менее 1,4 мкм. После предварительного подращивания определяется счетная концентрация колониеобразующих единиц в кубическом метре воздуха.
Основные технические характеристики: отбираемый объем пробы 20 - 9999 л; предел обнаружения колониеобразующих единиц 0,5 КОЕ/м ; питание универсальное — от сети переменного тока 220 ± 20 В частотой 50 Гц, от бортовой сети автомобиля 27,12 В, аккумуляторной батареи 12 В; потребляемая мощность не более 10 Вт; масса импактора не более 2,5 кг; габариты импактора не более 250 х 140 х 120 мм.
Электронная схема импактора обеспечивает возможность задания и контроля рабочих режимов и автоматическую калибровку. Управление осуществляется со стандартной 16-клавишной клавиатуры, на световом табло происходит автоматическая индикация рабочих режимов и возможных технических неисправностей.
Импактор рекомендован к применению приказом Минздрава РФ от 21.01.98 № 17, Сертификат № РОСС RU.ИMO4.H00128.
ТЕСТ-НАБОР ДЛЯ ДОМАШНЕГО КОНТРОЛИРОВАНИЯ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ.
Чрезвычайная важность тестирования на наличие в крови человека антител к ВИЧ накладывает на диагностическую лабораторию большую ответственность за точность полученного результата. Установлено, что применение домашнего контроля позволяет ужесточить условия работы с коммерческими диагностическими тест-наборами, а при верификационных исследованиях перейти к полуколичественному определению уровня специфических антител, а в целом стандартизовать проводимые исследования.В Московском городском Центре профилактики и борьбы со СПИДом, Иммуноло-гической лаборатории по диагностике ВИЧ-инфекции Комитета здравоохранения, Городского центра санэпиднадзора, г. Москва (разработчики Б.И.Шевелев, А.Я.Ольшанский, Е.Б.Редченко, Т.В.Преображенская, Н.Е.Климова) сконструировано 3 серии двух диагностических тест-наборов для домашнего контроля ВИЧ-инфекции, включающие 8 пулов сывороток: 4 содержащие антитела ко всем антигенам ВИЧ-1 и 4 - ВИЧ-негативных сывороток здоровых доноров. Все использованные тест-сыворотки не содержали антител к антигенам вирусов гепатитов А, В, С.
Разработка подобного рода тест систем весьма перспективна, поскольку применение домашнего контроля при верификационных исследованиях позволяет перейти к полуколичественной оценке уровней специфических антител в исследуемых сыворотках и на основе данных по оптической плотности контрольных сывороток тест-систем и ДК строить калибровочные кривые, что, в свою очередь, позволяет сопоставлять результаты, получаемые в различных тест-системах в разное время и, следовательно, отслеживать процесс индивидуальной сероконверсии и, вероятно, получить инструмент для контроля эффективности терапии.
Подготавливаются материалы по регламентации приготовления и использования данного диагностикума.
НЕИНВАЗИВНЫЙ СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ПИЛОРИЧЕСКОГО ХЕЛИКОБАКТЕРИОЗА.
В настоящее время одним из важных этиопатогенетических факторов заболеваний гастродуоденальной зоны является Helicobacter pylori (HP). Существует мнение, что инфицированность слизистой оболочки оказывает влияние на хронизацию течения гастродуоденальных заболеваний, обусловливает недостаточную эффективность их терапии.В связи с тем, что для данной инфекции не удается выявить патогномоничных признаков, большое значение приобретают методы лабораторной диагностики хеликобактериоза. Наиболее распространенные методы обнаружения HP являются инвазивными, так как связаны с проведением фиброгастроскопии и получением биоптатов. Недостатками методов выявления хеликобактеров являются не только ограниченные возможности использования лишь в высокоспециализированных учреждениях, безусловная инвазивность, но и технические факторы, влияющие на результат исследования, который зависит от места взятия биоптата. При использовании бактериологического метода затягивается срок получения результатов анализа до 7 дней.
Метод иммунологического исследования сыворотки крови на антитела к HP является инвазивным и сложным. Специфичность такого исследования 85—95%.
В Нижегородском НИИ детской гастроэнтерологии Минздрава РФ (В.Г. Дорофейчук, П.П. Потехин, Е.А. Жукова, Т.П. Колпакова, Н.3., Петрова, Н.Ю. Широкова) разработан неинвазивный способ обнаружения HP путем бактериоскопии осадка порции желудочного сока, полученной натощак. Обнаружение HP в случаях инвазии обусловлено непрерывно протекающим естественным процессом обновления слизистой оболочки с постоянной десквамацией отмирающих клеток покровного эпителия в просвет желудка и находящимися на их поверхности HP.
Способ осуществляют следующим образом: порцию желудочного сока, полученную натощак, центрифугируют при 3-4 тыс. об/мин в течение 30-40 мин, из осадка готовят препарат путем распределения 0,01 мл на площади диаметром 10 мм, высушивают и окрашивают по Гимзе с последующей бактериоскопией и подсчетом HP. Оценка по количеству микробов в поле зрения микроскопа при увеличении 900: до 20 бактериальных клеток +, до 50 клеток ++, более 50 клеток +++. Отсутствие характерных интенсивно окрашенных форм бактерий -.
Предложенный способ диагностики HP является высокоинформативным, так как позволяет получить интегративную оценку обсемененности независимо от локализации в различных отделах слизистой оболочки желудка.
Наряду с отмеченной информативностью к преимуществам способа следует отнести исключение инвазивности, что особенно важно в детской гастроэнтерологии. Способ позволяет за короткий срок (1,5 ч) определить наличие HP, своевременно назначить адекватное лечение и использовать способ в качестве объективного критерия оценки эффективности лечения. Способ диагностики HP не требует дорогостоящей аппаратуры, сложной методологии с использованием дорогих импортных и дефицитных отечественных реактивов, технически доступен для внедрения на всех этапах медицинского обслуживания.
ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯТРЕПОНЕМНЫХ АНТИТЕЛ.
Разработаны два варианта тест-системы для анализа любого количества проб: полистроловые планшеты ТИФА и мембрана с иммунофильтрацией на комплекте иммунофер-ментном мембранном фильтрационном КИМФ-02 (прибор КИМФ-02 разработан в Государственном НИИ приборостроения, прошел технические и медицинские испытания и рекомендован к серийному выпуску Минздравмедпромом РФ). В качестве иммуноферментного коньюгата тест-система включает моноклональные антитела к легким цепям иммуноглобулина человека, меченные пероксидазой, что позволяет повысить специфичность метода. Тест-система предназначена для проведения анализов даже в необорудованных лабораториях.I) ТИФА на планшетах. Антигены иммобилизировали на планшете в течение 18 часов в объеме 100 мкл с концентрацией 5 мг/кг в 0,01 М карбонатно-буферном растворе рН 9,5 блокировку незанятых мест на планшете проводили 10 мкл 5 % крличьей сыворотки (КС) в течение 20 минут. Другие реагенты вносили в объеме 50 мкл, кроме исследуемых сывороток, последние разводили в 200 раз 5 % КС и вносили в лунки в объеме 100 мклю. Блокировку план планшета КС, инкубацию с образцами сывороток, коньюгатом проводили в течение 30 минут при температуре 37 °С. В качестве субстрата использовали 0,02 % раствор 3,3' 5,5' - тетраметилбензидина в 0,1 М цитратном буфере рН 5,0, содержащем 0,04% перекиси водорода, реакцию останавливали равным объемом 5% серной кислоты. Учет результатов проводится на фотометре, измеряя оптическую плотность раствора при Е450. Положительными считаются пробы, оптическая плотность которых в 2 раза и более превышала значение контроля отрицательной сыворотки.
Б) Точечный ИФА на КИМФ - 02 (дот - ИФА). Комплект содержит фильтрующий модуль, в который помещают нитроцеллюлозную мембрану. Конструкция модуля позволяет концентрировать пробы, инкубировать и промывать мембрану от несвязавшихся компонентов. Насос обеспечивает вакуумирование модуля и нагнетание жидкости в гребенку промывателя. Отмывка мембраны под вакуумом сокращает время анализа, практически исключение ложноположительных результатов. Модуль обеспечивает одновременный анализ 96 проб за 60 минут. Объем пробы можно варьировать от 5 мкл до 1 мл. Расход диагностических препаратов сокращается в 4 раза и более.
Для анализа в модуле размещают нитроцеллюлозную мембрану с диаметром пор 0,45 мкм, смачивая ее 0,01М карбонатно-бикарбонатным буфером рН 9,6, а затем в ячейки модуля вносят антиген. Далее поступают как описано в методике постановки анализа на планшете, но сроки инкубации на всех стадиях сокращают: блокировку мембраны КС до 20 минут, инкубацию с образцами сыворотки -до 20 минут, с иммунопероксидазным конъюгатом - до 15 минут, субстратом - до 5 минут. Конъюгат и субстрат вносят по 20 мкл в ячейку для проявления ферментативной активности на мембране использовали субстрат, который в результате ферментативной реакции образует нерастворимый осадок -0,02% о-толидин в 0,2 М ацетатном буфере, содержащем 0,04% перекиси водорода, рН 5,5. Реакцию останавливали прибавлением в ячейки по 25 мкл 3% раствора молибденово-кислого аммония. В ячейках с положительными пробами мембрана окрашивалась в синий цвет различной интенсивности, в ячейках с отрицательными пробами мембрана не окрашивалась или была бледно голубого цвета.
Данная методика по полученным результатам сходна с такими высокочувствительными и высокоспецифичными общепринятыми серологическими реакциями, как реакция иммунофлюоресценции (РИФ) и иммуноферментный анализ (ИФА) и может быть использована в качестве подтверждающего теста при диагностике сифилиса.
Отличительными особенностями данной тест-системы являются:
- использование иммуноферментного конъюгата на основе мышиных моноклональных антител к легким цепям иммуноглобулина человека, что позволяет исключить неспецифические белок-белковые взаимодействия исследуемых сывороток с антивидовыми конъюгатами из поликлональных сывороток;
- применение кроличьей сыворотки для разведения исследуемых образцов и конъюгата, что позволяет исключить стадию обработки сывороток сорбентами или агрегированными иммуноглобулинами человека, которая рекомендуется для снятия неспецифических реакций при анализе с использованием других иммуноферментных систем.
Высокая чувствительность и специфичность определения антител с помощью ТИФА и дот-ИФА, простота и быстрота проведения анализа позволяют использовать эти методы для качественной и полуколичественной оценки антитрепонемных антител. Её эффективность, проверенная на практике, позволяет рекомендовать её для дифференцирования результатов, полученных в стандартных серологических тестах на сифилис. ТИФА с приборной регистрацией результатов анализа может быть использован для профилактических обследований на сифилис больших групп людей.
НОВАЯ ТЕСТ-СИСТЕМА ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ СЕРОДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА.
Беднова В.Н., Дмитриев Г.А., Бабий А.В., Милонова Т.И., Свищев К.Г., Марданлы С.Г., Центральный научно-исследовательский кожно-венерологический институт (дир. — акад. РАМН Ю.К. Скрипкин) Минздравмедпрома РФ, Москва.ИФА для выявления больных сифилисом не используется из-за значительной сложности реакции, субъективного учета ее результатов и отсутствия унификации по сравнению с ИФА на СПИД, гепатит и др. Кроме того, выпуск этой тест-системы практически прекращен из-за отсутствия сырья для сорбента.
В последние годы проведена работа по очистке антигена из бледных трепонем для ИФА на сифилис, что позволило упростить и сделать более экономичной сорбцию исследуемых сывороток крови и автоматически учитывать результаты реакции, что особенно важно при обследовании на сифилис больших групп населения, в частности доноров. Методика постановки теста была приближена к таковой при других заболеваниях.
Принцип метода заключается в соединении специфического комплекса антиген - антитело с иммунной антивидовой сывороткой, меченной ферментом, выявляемым субстратной смесью из веществ, изменяющих свою окраску в присутствии фермента. Постановка реакции заключается в адсорбции антигена в лунках полистиролового планшета для иммунологических реакций, отмывании лунок от не связавшихся ингредиентов. Для 1-й фазы реакции в лунки помещают исследуемые образцы сыворотки крови или спинномозговой жидкости и выдерживают их на антигене для образования комплекса антиген - специфическое антитело. Затем лунки промывают и вносят в них (2-я фаза) конъюгат в виде меченной ферментом антивидовой сыворотки для образования 2-го комплекса антиген - антитело, если в 1-й фазе антиген оказался связанным с сифилитическим антителом, находившимся в материале. Для выявления 2-го комплекса после промывания лунок осуществляют 3-ю фазу реакции, для чего в лунки вносят субстратную смесь, которая изменяет цвет под действием фермента. Реакцию останавливают раствором серной кислоты.
В настоящее время выпуск тест-системы разрешен филиалу ФАО "Феррейн" (142530, Московская область, г. Электрогорск Павлово-Посадского района, ул. Мечникова, 1) и экологической и биотехнологической фирме "ЭКОлаб" (142530, Московская область, г. Электрогорск Павлово-Посадского района, ул. Буденного, 5). Тест-системы близки по составу, к каждой прилагается инструкция по применению, которой следует руководствоваться при постановке реакции. Каждое предприятие выпускает 2 варианта тест-системы (комплекты I и II) для автоматического и визуального учета результатов.
Результаты ИФА учитывают спектрофотометрически (на приборе типа "Мультискан" или "Унискан") при длине волны 492 им. Нуль спектрофотометра устанавливают по воздуху. Оценка результатов производится только в том случае, если в лунках, в которые вносили контрольную положительную сыворотку, регистрируется оптическая плотность (ОП) не менее 1 ед. опт.пл., а в лунках, в которые вносилась контрольная отрицательная сыворотка, — не более 0,3 ед.опт.пл.
По 2 лункам, в которые вносили контрольную отрицательную сыворотку, определяют среднее арифметическое значение ОП отрицательного контроля (ОК). Исследуемая сыворотка считается отрицательной, если для соответствующей лунки ОП — ОК < 0,25 ед.опт.пл. Исследуемая сыворотка считается слабоположительной (2+), если 0,25 ед. опт.пл. < ОП — ОК < 0,50 ед.опт. пл. Исследуемая сыворотка считается положительной (3+), если 0,5 ед.опт.пл. < ОП — ОК < 1,0 ед. опт. пл. Исследуемая сыворотка считается резко положительной (4+), если ОП ~ ОК > 1,0 ед.опт.пл.
При визуальном учете реакция считается положительной при отчетливых различиях в интенсивности окраски в лунке с исследуемой сывороткой крови и контрольной отрицательной сывороткой. О слабоположительном, положительном и резко положительном результатах реакции судят по интенсивности окраски.
Образец положительно реагирующей (в том числе слабо реагирующей) сыворотки исследуют повторно. При повторном получении положительного результата у доноров исследуют сыворотку крови другими методами (КСР, РИТ, РИФ, РПГА), при проведении специфической серодиагностики сифилиса учитывают клинические, эпидемиологические данные, а также результаты КСР и других тестов.
Установлена 100% специфичность ИФА с визуальным учетом результатов и 98,3% специфичность автоматического теста. Чувствительность была равна 100% при обоих вариантах реакции. Полученные данные позволяют рекомендовать оба варианта ИФА для специфической серодиагностики сифилиса, а также для обследования на сифилис больших групп населения, в частности доноров. Во избежание технических ошибок данный тест следует использовать параллельно с микрореакцией преципитации с кардиолипиновым антигеном.
ВЫЯВЛЕНИЕ Chlomydia trachomatis, Mycoplosmo homhis и Ureopiasma urealiticum МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ.
Исследования, проведенные независимо в клиниках разных стран, показали, что в 50-90% случаев нарушения репродуктивной функции человека вызваны смешанными инфекциями мочеполовых путей, среди которых наиболее часты негонококковые урогени-тальные инфекции, в частности, хламидийная и микоплазменная. Длительное бессимптомное течение и множественные клинические проявления значительно затрудняют симптоматическую диагностику этих заболеваний. Не всегда эффективны и традиционные иммунологические методы анализа, т.к. инфекции обычно протекают в латентной форме. Дороговизна и трудоемкость выделения возбудителя в культуре клеток существенно затрудняют использование этой процедуры в практике лабораторной диагностики.
Современный высокочувствительный и специфичный метод диагностики инфекций, основан на уникальности их генома — полимеразная цепная реакция (ПЦР). В ряде лабораторий показано, что ПЦР по основным параметрам не уступает классическому методу клеточных культур. Метод ПЦР сделал возможным выявление не только острых, но и латентных инфекций, а также проведение достоверных эпидемиологических и статистических исследований распространенности различных возбудителей, их совместной встречаемости, сезонных колебаний в протекании заболевания и эффекта внести лечения.
Жданов А.В., Малинина Э.В., Бурменская О.В., Файзуллин Л.З., Кулаков В.И., Сухих Г.Т., Бродский М.Ю., Говорун В.М., Халилов Э.М. из Научного центра акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН; НИИ физико-химической медицины Министерства здравоохранения и медицинской промышленности России, г. Москва произвели клиническую адаптацию метода ПЦР для диагностики негонококковых урогенитальных инфекций. Материалом для исследования являются эпителиальные клетки дистального участка уретры мужчин и цервикального канала женщин. Образцы помещают в физиологический раствор и хранят при -20°С до 1 мес. В одной пробе одновременно определяют три возбудителя: С. trachomatis, M. ho minis и U, urealiticum. Подготовку клинических проб и реакцию амплификации проводят согласно методике. Клетки лизируют раствором, содержащим 6 М гуанидинтиоцианат, ДНК сорбируют на микропористом стекле, после серии отмывок элюируют и анализируют методом ПЦР. Реакцию проводят в объеме 25 мкл в течение 30 циклов на программируемом термостате "БИС" (Научно-производственное объединение "Вектор"), используя праймеры, амплифицирующие фрагменты генов 16S РНК возбудителей:
5'-CACGAGCTGACGACAACCATGCA-3', R1 - универсальный праймер;
З'-ССТТТСССАСССТТТТССАТС-З1, R2 - праймер для детекции U. urealiticum;
5'-GGTTAGCAATAACCTAGCCGCGA-3', R3 - праймер для детекции М. hominis,
5'-AAAGGGCGTGTAGGCGGAAAG-3', R4 - праймер для детекции С. trachomatis.
Кроме этого, призводится дополнительное обследование пациентов с использованием других пар праймеров:
5'-GATCGGTTrTCTCTTCGGTA 3'
5'-TCCATCGAGTTCTAGTTGCC-3', в плазмиде pCHLl С. trachomatis амилифицируется (фрагмент 507 пар нуклеотидов (п.н.);
5'-GATGGTAAGTTAGTTGCTGAC-3'
5'-ACGACGTCCATAAGCAACT-3', в области гена уреазы U. Urealiticum ампилифицируегся фрагмент 456 п.н.;
5'-СТАССССТА'ГТТТОССАОТГОСТАС-3'
5'-ТАТТССТССАТААТСССССТАТСАА-3', в области гена адгезина Р50 М hominis амплифицируется фрагмент 227 п.н.
Универсальность и высокая специфичность ПЦР позволяют диагностировать в одной постановке С. trachomatis, M. hominis и U. urealiticum одновременно. Высокая чувствительность ПЦР и хорошая воспроизводимость полученных результатов дают основание рекомендовать данную диагностическую систему к широкому использованию в клинической практике.
ДЕТЕКЦИЯ CHLAMYDIA TRACHOMATIS И UREAPLASMA UREALYTICUM МЕТОДАМИ ГИБРИДИЗАЦИОННОГО АНАЛИЗА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДНК-Рt[(dien)Cl]CL-ЗОНДОВ И ПЦР-АНАЛИЗА.
Кисилева В.И., Щербо С.Н., Зайцева С.П., Поверенный A.M. Медиицнский радиологический научный иетнр РАМН, 249020 г. Обнинск Калужской обл., ул. Королева, 4; факс: (095)255-24-86, электронная почта:
Этот e-mail адрес защищен от спам-ботов, для его просмотра у Вас должен быть включен Javascript
АО "Внедрение систем в медицину" ("ВСМ"), 117334 Москва, ул. Вавилова, 34/5; факс: (095)135-99-24.
В настоящее время для идентификации бактериальных и вирусных инфекций используют методы, основанные на обнаружении специфических антигенов возбудителя или на определении характерных для него структур генетического материала. Наиболее перспективным является ПЦР-тест, но его применение ограничивает высокая сложность технического исполнения. По этой причине гораздо более подходящей для массовых анализов может оказаться техника нерадиоизотопного гибридизационного теста.
Предложен метод ДНК-диагностики возбудителей инфекционных заболеваний в образцах клинического материала. Суть, его заключается в детекции специфических нуклеотидных последовательностей в ДНК, выделенных из этих образцов, методом гибридизационного анализа с одновременным контролем общего содержания ДНК в каждой пробе. Для такого контроля предложен простой полуколичественный иммуноферментный тест с помощью антител к денатурированной ДНК, выполнение которого связано практически полностью ,с теми процедурами, материалами и растворами, которые использовались в гибридизационном тесте. Информация о содержании ДНК в пробе необходима для адекватной трактовки результатов гибридизационного анализа. В качестве метки для зонда использовали Pt[(dien)Cl]Cl - диэтилентриаминхлорплатина, а для детекции ДНК-гибридов - аффинные антитела к ДHK-Pt[(dien)Cl]Cl и антитела к кроличьему иммуноглобулину, конъюгированные с фосфатазой. Результаты гибридизационного анализа хорошо совпадают с данными ПЦР-теста. Предлагаемый метод прост, относительно дешев, пригоден для массовых анализов.
ПЦР-анализ состоит в следующем: использованные в работе праимеры синтезируют на синтезаторе. Реакционная смесь для проведения ПЦР содержит в 25 мкл 67 мМ Tris-НС1, рН1 8,8, 16,6 мМ (NH4)2SO4, 2,0 мМ MgCl2, 0,01 %-ный БСА, 200 мкМ дсзоксинуклео-тидтрифосфаты (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), по 15 пмоль каждого из двух праимеров, 5-10 мкл анализируемой пробы. Добавляют 2 ед. ДНК-полимеразы (Taq-полимеразы). На поверхность реакционной смеси наслаивают 30 мкл стерильного вазелинового масла. Пробирки помещают в амплификатор и осуществляют 30 циклов амплификации, включающих в себя следующие этапы: денатурацию ДНК при 94° (1 мин), отжиг праимеров при 57° (1 мин), удлинение цепи при 72° (1,5 мин). Амплифицированную ДНК анализируют методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле.
ДНК-диагностика бактериальных и вирусных инфекции, патогенных микроорганизмов начинается с отбора клинических проб у больных (кровь, эпителиальные клетки, смывы со слизистой оболочки, слюна, моча) и выделения ДНК из них. В зависимости от состояния больного, способа отбора проб и выделения нуклеиновой кислоты эти пробы могут сильно различаться по содержанию ДНК в них, что может привести к недостоверности полученных результатов. Количественная оценка ДНК традиционными физико-химическими методами затруднена из-за очень малого, как правило, объема проб, большого их числа и необходимости высокочувствительных приборов. Предложен чрезвычайно простой полуколичественный иммунохимический тест на содержание ДНК с помощью антител к денатурированной ДНК (дДНК), позволяющий анализировать одновременно сколь угодно большое количество проб. При этом охвачен диапазон концентраций, который можно реально предполагать для ДНК, выделенных из клинического материала (100-1 мкг на 1 мл). На мембранах одинаковым образом иммобилизируют ДНК из клинического материала и контрольную ДНК тимуса теленка, раститрованную двукратно, начиная со 100 нг. ДНК на первой мембране гибридизируют с ДНК-зондом Chlamydia trachomatis, модифицированным Pt[(dien)Cl]Cl, и идентифицируют полученные гибриды последовательной обработкой мембран антителами к ДНК- Pt[(dien)Cl]Cl, вторичными антителами, коньюгированными с фосфатазой, и хромогенными субстратами NBT и BCIP. ДНК на второй мембране обрабатывают антителами к дДНК и далее так же, как и в первом случае, вторичными антителами, коньюгированными с фосфатазой и субстратом. (Детекция ДНК на этих мембранах отличается только на стадии обработки специфическими антителами, все остальные процедуры - одинаковые). Сравнивая интенсивность окраски в точках нанесения ДНК клинических проб и в точках, соответствующих раститровке контрольной ДНК, можно оценить количество ДНК в каждой пробе. Далее, нормируя интенсивность гибридизационного сигнала относительно количества ДНК в пробе, можно получить адекватную и достоверную информацию о специфичности этого сигнала.
Предложенный гибридизационного анализа с использованием Pt[(dien)Cl]Cl в качестве метки для ДНК-зондов и с последующей иммуноферментной детекцией ДНК-гибридов может с успехом использоваться для выявления возбудителей инфекционных заболеваний в клиническом материале.
Сравнение результатов гибридизационного и ПЦР-анализов клинических образцов на содержание Chlarnyclia irachomails и Ureciplasma urcalytlcurn показало, что они дают хорошее совпадение. Однако в некоторых случаях не хватает чувствительности метода гибридизационного анализа. ПЦР-техника, безусловно, является более информативной в силу более высокой чувствительности, однако она также имеет целый ряд ограничений в применении. На основании этого полагают, что техники гибридизационного анализа и полимеразной цепной реакции могут удачно дополнять друг друга при массовых анализах клинического материала на содержание патогенных микроорганизмов, бактериальных и вирусных инфекций. Методом гибриднзационного анализа, как наиболее простым и доступным (с одновременным определением содержания ДНК в пробе), целесообразно проводить скрининговое обследование и выявлять пробы со строго положительными и строго отрицательными результатами. Далее те пробы, которые вызывают сомнение, т.е. для которых невозможно получить четкий результат из-за недостаточной чувствительности метода гибридизационного анализа, следует проверить методом ПЦР.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ПЕРЕДАВАЕМЫХ ПОЛОВЫМ ПУТЕМ.
С. Н. Щербо, В. Б. Макаров. Городской центр ДНК-исследований госсанэпиднадзора Москвы, АО "Внедрение систем в медицину", Москва.На основе использования метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) разработаны наборы реактивов для выявления возбудителей ряда заболеваний, передаваемых половым путем: хламидий трахоматис (ХламАм), микоплазмы гоминис (МикгАм), микоплазмы гениталиум (МикАм), уреаплазмы уреалитикум (УреАм), гонококка (ГонАм), вируса простого герпеса (ГерАм) и цитомегаловируса (ЦитАм). Проведены исследования возможности применения метода в клинической практике. Материалом для исследования служат соскобы со слизистой, слюна и моча. Высокая чувствительность метода и использование разработанного авторами комплекса лабораторных изделий позволяют определять указанные возбудители в минимальных количествах клинического материала. Проведена сравнительная оценка эффективности метода ПЦР по сравнению с традиционными методами, показаны преимущества и ограничения применения метода в клинической практике. Создана четырехпраймерная система для одновременной детекции микоплазмы гоминис и микоплазмы гениталиум в одной пробе. Характеристика и описание метода содержатся в Методических рекомендациях МЗМП РФ М 95-106 "Диагностика хламидийной, микоплазменных и герпесвирусных инфекций методом цепной полимеразной реакции".
ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКА АНАЭРОБНОЙ ИНФЕКЦИИ
А. И. Карпищенко, К. Н. Зеленин, Г. И. Элькин, Военно-медицинская академия, Санкт-Петербург для экспресс-диагностики анаэробной инфекции предложили метод газожидкостной хроматографии.С целью диагностики бактериальной контаминации в крови и раневом отделяемом определяли низшие карбоновые кислоты (C2 - C4), являющиеся маркерами анаэробных бактерий, и глиоксиловую кислоту — ключевое соединение глиоксилатного цикла, свойственного аэробным бактериям.
Кислоты экстрагировали спиртом и подвергали метанолизу йодистым метилом в присутствии тетрабутиламмония хлорида, рН доводили до 8,8 - 10,0 и смесь инкубировали 45 мин при 80°С.
Полученные метиловые эфиры кислот хроматографировали на насадочной колонке с 15% FFAP на газовом хроматографе "Цвет-500М" (Россия) с пламенно-ионизационным детектором. Условия хроматографирования: температура термостата – 130°С, детектора -180°С, скорость потока Не 30 мл/мин, Н2 - 30 мл/мин, воздуха - 300 мл/мин.
Общая продолжительность анализа составила 2 ч, в результате получены пики, соответствующие по времени удерживания метиловым эфирам низших карбоновых и глиоксиловой кислот.
Предложенный экспресс-метод отличается высокой надежностью, простотой и позволит значительно сократить время, необходимое для постановки диагноза.
ДИАГНОСТИКА КОМПЛЕКСА MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ.
Мирлина Е.Д., Манчиева О.А., Вишневский Б.И., Зильберглейт А.С., Ланцов В.А. Межведомственный центр молекулярной диагностики Петербургского института ядерной физики им. Б. П. Константинова РАН и Санкт-Петербургской государственной академии педиатрии МЗ РФ, Гатчина, Ленинградская обл., 188350 Санкт-Петербургский НИИ фтизиопульмонологии МЗ и МП РФ.Разработка быстрого и чувствительного метода диагностики микобактериальных инфекций, основанного на современных достижениях молекулярной биологии, является неоспоримо актуальной задачей. Достаточно указать на тот факт, что традиционные бактериологические методы изоляции возбудителя инфекции требуют в случае М. tuberculosis до 8 нед, а прямым микроскопическим исследованиям клинических образцов недостает чувствительности и специфичности. Дополнительные трудности возникают при применении упомянутых методов к диагностике тканевых образцов.
Разработан основанный на полимеразной цепной реакции (ПЦР) метод молекулярной диагностики комплекса Mycobacterium tuberculosis в клинических образцах, применимый для анализа как биологических жидкостей, так и образцов тканей. Метод включает простой одностадийный способ выделения тотальной ДНК образца, процедуру четырех-праймерной амплификации и индикацию результата с помощью электрофореза в ПААГ. Установленный порог чувствительности метода составил 102 бактериальных клеток на 1 мл клинического образца. Разработана система контроля контаминации и меры по ее предотвращению. Проведен анализ клинических образцов в сравнении с ранее существовавшими методами.
В качестве образцов для исследования используют мокроту, промывные воды бронхов, бронхо-альвеолярную лаважную жидкость (БАЛЖ) от больных различными формами туберкулеза легких
В качестве мишени для полимеразной цепной реакции использовали последовательность IS986, уникальную для МТС. Данная диагностическая процедура позволяет устойчиво обнаруживать в клинических образцах представителей МТС в концентрации 102 клеток/мл. Проводился сравнительный анализ ПЦР с посевом и микроскопией. Ложно-отрицательный результат анализа с помощью ПЦР (+/-) наблюдался в 3,5%. Диагностический тест, основанный на ПЦР, не исключает, а лишь дополняет разнообразные традиционные методы диагностики туберкулеза. Он особенно полезен в случае верификации сомнительного диагноза, так же, как и в случаях начальной стадии заболевания, требующей высокой чувствительности. Три качества ПЦР-диагностикумов - быстрота, чувствительность и достоверность - делают их незаменимыми в случае профилактического скрининга групп риска.
МЕТОД НЕСТЕД-ПЦР В ДИАГНОСТИКЕ ТУБЕРКУЛЕЗА
Скотникова О.И., Соболев А.Ю., Демкин В.В., Николаева Н.П., Носова Е.Ю., Исаева Е.Л, Мороз А.М., Литвинов В.И., Московский городской научно-практический Центр борьбы с туберкулезом Комитета здравоохранения г. Москвы; Институт молекулярной генетики РАН, Москва.Среди методов генодиагностики инфекционных заболеваний наиболее широкое распространение получила ПЦР|. Описано несколько ПЦР-систем для выявления Mycobacterium tuberculosis (МВТ). Среди генетических мишеней, используемых для этих целей, наибольшее распространение получили тест-системы, основанные на амплификации элемента IS 6110. Использование ПЦР позволяет радикально сократить сроки выявления инфекции и существенно повысить чувствительность анализа. В практической диагностике при проведении ПЦР следует учитывать ряд факторов, связанных с особенностями анализируемого клинического материала, влияющих на результаты выявления возбудителя: неоднородность клинических проб (различное содержание возбудителя), наличие веществ, ингибирующих амплификацию, потеря возбудителя в процессе обработки клинических образцов. В связи с этим общепринятая одноэтапная ПЦР не всегда обеспечивает необходимую чувствительность и надежность. Другим вариантом ПЦР, обладающим повышенной чувствительностью и специфичностью, но менее распространенным в диагностике инфекций, является нестед-ПЦР (Н-ПЦР). Особенность метода состоит в применении двух пар праймеров (внутренней и внешней) и проведении двух реакций амплификации. Каждая пара праймеров участвует в своей стадии амплификации со своими режимами денатурации, отжига и синтеза.
Разработана тест-система по выявлению Mycohactenum tuberculosis и М. bovis в биологических образцах различного типа, основанная на амплификации участка элемента IS 986 (нестед-ПЦР). Сконструированы внешние праймеры, подобраны условия амплификации (температуры отжига для I и II этапов, количество циклов для каждой стадий амплификации, ингредиенты амплификационной смеси, условия обработки различных биологических проб). Отработанные параметры повышают эффективность и значительно удешевляют выявление микобактерий. Сконструированы внешние праймеры и отработаны стадия за стадией все условия амплификации более чувствительного метода Н-ПЦР.
Предлагаемая тест-система Н-ПЦР отличается высокой эффективностью. Простота обработки образца сокращает время выявления возбудителя. Возможность ее использования в практической медицине очень важна как для диагностики туберкулеза, так и для контроля за терапией. Большим преимуществом является низкая стоимость выявления возбудителя.
Интерн Военно-медицинской академии Р.А. Яновский
You are reading Диагностика и выявление возбудителей инфекционных заболеваний. Начало articles