Диагностика и выявление возбудителей инфекционных заболеваний. Продолжение
СЕРОЛОГИЧЕСКИЙ КРИНИНГ НЕОНАТАЛЬНОГО КАМПИЛОБАКТЕРИОЗА
Попова Е. Д., Пермская государственная медицинская академия, лаборатория серологических препаратов Пермского НПО "Биомед" (зав. - Райхер Л.И.).Биологические особенности кампилобактерий (требовательность к питательным средам, газовой среде культивирования), а также разнообразие видов привели к тому, что бактериологическая диагностика КБ в практическом здравоохранении осуществляется редко. Разработана оригинальная, высокоспецифичная тест-система для серологического скрининга кампилобактериоза методом ИФА, исключающая возможность перекрестных реакций. С этой целью используют сравнительное определение титра антител к специфическому кампилобактериозному и общим антигенам грамнегативных энтеробактерий как основание для верификации серологического диагноза. Одновременно в ИФА используют 3 вида индикаторных антигенов:
- специфический — кампилобактериозный, приготовленный по методу Т. И. Кузьминой и Б. Л. Черкасского из штамма Carnpylobacter jejuni, тип I путем обработки формалином;
- общий энтеробактериальный антиген - растворимый дериват липида A Re 595 Salmonella minnesota, приготовленный по модифицированному проф. Л. И. Райхером методу Zaianos;
- общий энтеробактериальный антиген — очищенный ЛПС Echerichia Coli фирма "Siqma".
Проведен серологический скрининг у 400 новорожденных с энтероколитами. Применяя для обследования детей, больных энтероколитами, с помощью ИФА 3 типа антигенов (кампилобактериозный и общие энтеробактериальные), учитывают фоновые реакции за счет перекрестно реагирующих антител и отдиффенцируют специфические результаты, подтвердив пригодность кампилобактериозного антигена для серологического скрининга. За диагностический был принят титр антител 1:800 к кампилобактеру.
При проведении исследования используют два контроля: положительный — сыворотка с содержанием антител к кампилобактеру с титром 1:6400 и отрицательный — сыворотка, не содержащая антител к кампилобактеру. В тех случаях, когда требуется дополнительная верификация специфичности результатов, ее осуществляют путем сравнения его с данными параллельного титрования тех же сывороток в ИФА с общими антигенами энтеробактерий. Полученный и впервые использованный в ИФА антигенный препарат -растворимый дериват липида А энтеробактерий позволяет не только тестировать уровень фоновых перекрестных реакций, но и выявлять у больных стимуляцию антиэндотоксического иммунитета, что важно для патогенетической характеристики инфекционного процесса.
ТЕСТ ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ВЕРИФИКАЦИЙ БОРРЕЛИОЗА.
Крючечников В.Н., НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН, Центр по боррелиозам МЗ России, МоскваОсновные методы серологической диагностики болезни Лайма (БЛ) разработаны в 80-е годы. К этим методам относятся, главным образом, различные модификации РЭМА (ELISA) с цельноклеточным или сонифицированным антигеном, значительно реже - с его жгутиковой или иными фракциями и иногда - иммуноблотинг. Еще реже применяют РПГА и РА, главным образом, в отдельных научных работах, но не в постоянной клинической и эпидемиологической практике. Стандартизованных общенациональных и международных тестов до сих пор не существует. В 90-е годы принципиально новых серо-диагностических разработок почти не предлагалось, и сейчас международные и национальные центры продолжают, в основном, попытки стандартизации РЭМА.
В России разработали и начали ставить НРИФ с антигеном Borelia persica с 1983, а с B.burgdorferi — с 1985 г. Это достаточно удобная и наиболее экономически доступная из известных реакций. Тем не менее, эта реакция до сих пор остается для России единственной в массовой практике и, кроме того, связана с рядом ограничений (необходимость располагать дорогим люминесцентным микроскопом, необходимость немедленного прочтения результатов реакции, высокая утомляемость исполнителя и вредность длительной люминесцентной микроскопии для его зрения).
Предложена серологическая реакция, которая позволяет обойтись без люминесцентного микроскопа в работе с тем же корпускулярным антигеном. Она отличается простотой и доступностью в постановке и стабильностью сохранения результатов теста.
С этой целью модифицирован применительно к серологической практике феномен непрямого иммуноферментного метода выявления боррелий на основе меченых пероксидазой антител к определенным глобулинам человека. В качестве хромогена используется т.н. ДАВ (3,3 диаминобензидинтетрагидрохлорид). Аналогичные реакции до сих пор применяли, главным образом, для выявления возбудителей и других антигенных субстанций в патоморфологических исследованиях как на световом, так и на электронно-микроскопическом уровнях (например, для выявления спирохет, лептоспир в гистологических срезах).
В большинстве модификаций иммуноферментного метода тесты завершаются непосредственно в растворах или жидких средах (в лунках, пробирках, под покровными стеклами), что дает нестойкие результаты, которые необходимо немедленно считывать, т.к. при подсыхании или длительном стоянии выпадает осадок, происходит выцветание и т.п. Предлагаемый тест считывается с отмытых сухих препаратов на предметных стеклах, что обеспечивает стойкость полученных результатов.
В работе используют сыворотки крови и стандартный антиген штамма B..afzelii Ip 21. Непрямая микромодификация иммуноферментной реакции на стеклах (НМИФ) принципиально сходна по технике постановки с НРИФ и состоит из следующих основных этапов:
- На сухие капли антигена на предметном стекле наносят 2-кратные разведения тестируемых сывороток в забуференном фосфатом (0,01 М, рН 7,2) физрастворе (ФБФ). Стекла инкубируют во влажной камере при 37°С в течение 40 мин. Этот этап ничем не отличается от аналогичной стадии модикации НРИФ.
- После двукратного 10 мин отмывания в ФБФ стекла споласкивают дистиллированной водой (ДВ) и быстро обсушивают. На стекла наносят меченое пероксидазой антитело против G класса иммуноглобулинов человека в рабочем разведении и вновь инкубируют 40 мин во влажной камере при 37°С. Указанным выше образом, повторно промывают ФБФ, ДВ и высушивают. Во время проведения второго этапа реакции (примерно за 30 мин до начала 3-го этапа) готовят проявляющий раствор по следующей схеме: в 20 мл 0,05 М трис буфера (рН 7,6) растворяют 12 мг ДАБ (раствор А); в 10 мл такого же буфера растворяют 10 мкл 33% Н2О2 (раствор Б). Смешивают 1 мл раствора Б с 9 мл раствора А. Растворы А, Б и их смесь сохраняют до использования не более 30 мин при 30°С в темноте.
- Наносят на стекла раствор А на 10 мин (30°С, в темноте). Ополаскивают трис буфером, быстро обсушивают и наносят смесь растворов А и Б (по п.2) на 20 мин при 30°С в темноте. Споласкивают в 5 — 6 сменах ДВ и высушивают. Считывают результаты реакции под световым микроскопом любой конструкции с иммерсионным объективом 90 - 100 крат при общем увеличении 700 — 800 крат. В положительных тестах клетки антигена окрашены в интенсивный коричневато-пурпурный цвет, тогда как в отрицательных тестах клетки выглядят бледными, почти бесцветными.
После обширных клинико-лабораторных и серолого-эпидемиологических испытаний эта реакция может оказаться перспективным тестом для массовых серологических обследований.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОРИНА ИЗ ВНЕШНЕЙ МЕМБРАНЫ YERSEVIA PSEUDOTUBERCULOSIS ДЛЯ СЕРОДИАГНОСТИКИ ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗА.
Новикова О.Д., Портнягина О.Ю., Фролова Г.М., Соловьева Т.Ф., Павлова Т.Н., Тимченко Н.Ф.,.Прокопенкова А.П, Оводов Ю. С., Отдел молекулярной иммунологии Тихоокеанского института биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН, Владивосток.Псевдотуберкулез, или дальневосточная скарлатиноподобная лихорадка, вызываемая Yersinia pseudotuherculosis, является инфекционным заболеванием с полиморфной клинической картиной, что значительно затрудняет диагностику. Трудности возникают, например, при дифференциальной диагностике псевдотуберкулеза с инфекционным вирусным гепатитом, особенно на ранних этапах обследования больных. В настоящее время для клинической диагностики дальневосточной скарлатиноподобной лихорадки широко используется реакция непрямой гемагглютинации (РИГА) с коммерческим диагностикумом на основе липополисахарида (ЛПС) IB серовара Y. pseudotuberculosrs. Имеются сообщения о разработке иммуноферментных тест-систем и иммуноглобулиновых препаратов для экспресс-диагностики псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза. Однако использование в этих тестах типоспецифических антигенов (ЛПС и антигена Буавена) ограничивает возможности указанных выше способов диагностики, поскольку заболевание могут вызывать возбудители не только I серовара, но и II, III, IV и V.
Показано, что порин из внешней мембраны У. pseudotuherculosis является видоспецифическим агентом возбудителя псевдотуберкулеза. Иммуноферментный анализ на основе порина позволяет диагностировать антитела ко всем серовариантам -К pseudotuber-culosis. Разработана тест-система на основе видоспецифического антигена Y. pseudotuber-culosis - порообразующего белка из наружной мембраны бактерий, позволяющей выявлять антитела к возбудителю псевдотуберкулеза различных серовариантов.
В качестве антигена используют порин, выделенный из внешней мембраны Y. pseudotuberculosis (штамм 598, IB серовар). Образец порина содержит 75-80% белка и не более 3-4% ЛПС. Постановку иммуноферментного анализа (ИФА) осуществляют по стандартной методике. Реакцию проводят забуференном физиологическом растворе, рН 7.4, содержащем 0.1% додецилсульфат натрия. По результатам проведенных экспериментов по оптимизации условий сорбции порина на планшетах были выбраны следующие параметры тест-системы: а) концентрация порина — 20 мкг/мл; б) рН буфера 9.0; в) планшеты сенсибилизировали при 37°С в течение 2 ч; г) блокирование неспецифического связывания проводили 0.1% раствором твина-20 в течение 16ч при 4°С.
Результаты окрашивания регистрируют на спектрофотометре при 492 нм. Полученные результаты выражают в единицах оптической плотности. За минимальный диагностический титр в ИФА могут быть приняты разведения 1:400 кти 1:800.
ИФА на основе порина — видоспецифического антигена из наружной мембраны Y. pseudotuherculosis является достаточно эффективным, специфичным и достоверным методом серодиагностики псевдотуберкулеза, пригодным для внедрения в клиническую практику. Преимуществом данной разработки является возможность диагностики заболевания на ранних стадиях развития инфекционного процесса. Работа поддержана Государственным комитетом по науке и технике "Приоритетные направления генетики" от Института биологии гена РАН (грант 4-92).
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РОДОСПЕЦИФИЧЕСКОГО ЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗА И ИЕРСИНИОЗОВ.
Тимченко Н.Ф., Павлова Т.Н., Андрюков Б.Г., Венедиктов B.C., Новикова О.Д., НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, Владивосток.В структуре инфекционной заболеваемости населения доля псевдотуберкулеза и иерсиниоза велика. Для иммунодиагностики этих болезней в настоящее время применяют официнальные препараты. Однако иерсиниоз и псевдотубсркулез могут вызывать и другие серовары возбудителей. Следовательно, РИГА с имеющимися официнальными диагностикумами не позволяет выявлять заболевания, вызванные другими серовариантами возбудителей. Кроме того, неясна роль других видов иерсиний в заболеваемости людей.
Сконструирован родоспецифический иерсиниозный эритроцитарный диагностикум на основе термостабильных белков наружной мембраны иерсиний, ассоциированных с пептидогликаном.
Получено 9 типов диагностикумов, сенситином в которых являлись ПГ-белки, выделенные из штаммов иерсиний (Y. pseudotuberculosis 512 (I серовар), Y. enterocolitica 164 (03), Y. kristensenii 6579, Y. federikenii 1242, Y. intermedia 6819. Все эти диагностикумы испытаны в РИГА для иммунодиагностики псевдотуберкулеза и иерсиниоза.
РИГА ставили но общепринятому методу. В реакции использовали 0,5% взвесь сенсибилизированных эритроцитов.
Независимо от вида иерсиний, из которых получали ПГ-белки, диагностикум на их основе является родоспецифическим и высокочувствительным. Использование родоспецифического диагностического препарата позволит значительно ускорить и улучшить иммунодиагностику инфекций, вызываемых бактериями рода Yersinia. Это будет способствовать осуществлению своевременных лечебно-профилактических мероприятий.
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ В ДИАГНОСТИКЕ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ У ВИЧ-ИНФИЦИРОВАННЫХ ПАЦИЕНТОВ.
Шипулина О.Ю., Шахгильдян В.И., Шипулин Г.А., Кравченко Л.В., Серебровская Л.В., Покровский В.В., Центральный НИИ эпидемиологии Минздрава РФ, Российский центр профилактики и борьбы со СПИДом Минздрава РФ, Москва.Разработана простая и стандартная методика выявления ДНК цитомегаловируса (ЦМВ) в лейкоцитах крови и определения ее титра с помощью полимеразной цепной реакции. При использовании данной методики при обследовании пациентов с разными стадиями ВИЧ-инфекции и разной концентрацией СD4-клеток выявлена связь между высокими титрами ДНК ЦМВ и возникновением манифестной цитомегаловирусной инфекции у пациентов с низким иммунным статусом. Установлено клиническое значение различных титров ДНК ЦМВ у пациентов с ВИЧ-инфекцией. Показана возможность применения данного метода для оценки эффективности противовирусной терапии.
Цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ) — одно из самых частых и тяжелых оппортунистических заболеваний у людей с глубокими поражениями иммунной системы, которое нередко приводит к летальному исходу. Среди существующих лабораторных методов диагностики ЦМВИ у пациентов с ВИЧ-инфекцией наибольшие надежды связывают с полимеразной цепной реакцией (ПЦР), которая позволяет не только выявлять ЦМВ в биологических жидкостях и тканях, но и определять его количество, что дает возможность следить за изменением вирусной нагрузки в процессе болезни и при проведении специфической противовирусной терапии. Однако в настоящее время не существует коммерческой ПЦР-тест-системы для выявления ЦМВ и определения его концентрации в клиническом материале, и каждая группа исследователей использует собственный протокол, часто сложный для воспроизведения, требующий дорогого и не всегда доступного оборудования и реактивов.
Цель представленной работы заключалась в разработке простого и стандартного способа выявления ЦМВ и определения его количества в клетках крови с помощью ПЦР, оценке разработанного метода в диагностике активной ЦМВИ и слежении за эффективностью лечения у ВИЧ-инфицированных пациентов.
Кровь берут из вены утром натощак в пробирки с 1/10 объема 3% ЭДТА, отделяют лейкоциты, подсчитывают их концентрацию в камере Горяева и готовят грубый лизат по Е. Kawasaki из 106 клеток в 100 мкл лизирующего буфера.
Амплификация участка ДНК ЦМВ с помощью ПЦР: праймеры выбрали в консервативной области 4-го экзона гена MIE 1. Последовательности праймеров: прямой: 5'-сса-agc-ggc-ctc-tga-taa-cca-agc; обратный: 5'-act-ggt-cag-cct-tgc-ttc-tag-tca-cc. Концентрацию геномов ЦМВ определяют с помощью nested-PCR (дополнительная амплификация с внутренними праймерами). Реакцию проводят в термоциклерах отечественного производства (фирмы "ДНК-технология") в реакционном буфере следующего состава: 67 мМ трис-НС1 рН 8,4, 16 мМ сульфата аммония, 0,1 мМ меркаптоэтанола, 2,5 мМ сульфата магния, 0,125 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, 0,25 мМ дезоксинуклеотидтрифосфатов, по 15 пмоль каждого праймера, 2,5 ед. Tag-полимеразы. В реакцию 6tpen 10 мкл подготовленного клетчатого лизата или его разведении. Проводят 45 циклов ПЦР при следующих температурных режимах: 95°С — 1 мин, 67°С — 1 мин, 72°С — 1 мин — 10 циклов; 95°С — 30 с, 65°С — 30 с, 72°С — 30 с — 35 циклов с обязательным использованием техники "горячего старта".
Детекция продуктов ПЦР: продукты ПЦР анализируют электрофоретическим разделением в 1,75—2% агарозном геле, содержащем краситель (бромид этидия) в концентрации 1 мкг/мл, используя трис-боратный электрофорезный буфер. После проведения электрофоретического разделения ДН К (длина пробега бромфенолового синего составляла 4 -5 см) гель просматривают в ультрафиолетовом свете, используя трансиллюминатор "Флу-скоп", и фотографировали на пленку "Микрат ЗОО". Длина амплифицированного продукта составляла 500 пар нуклеотидов.
Определение титра ДНК ЦМВ: готовят 4 10-кратных разведения исходного лизата, содержащего ДНК из 106 лейкоцитов в 100 мкл. Для разделения используют лизирующий буфер. Проводят реакцию амплификации с каждым разведением, включая исходный лизат. Наличие ПЦР-сигнала только в исходной пробе соответствует титру 1:1 (или 1+), в исходной пробе и 1-м разведении - 1:10 (или 2+), в 2 разведениях - 1:100 (или 3+), в 3 - 1:1000 (или 4+), наличие специфической полосы во всех 4 разведениях соответствует титру 1:10 000 (или 5+).
При оценке клинического значения различных титров ДНК ЦМВ в крови получены следующие результаты. Высокий титр ДНК ЦМВ (1:1000 и более) определен у пациентов, 77% из которых уже имели манифестную ЦМВИ, подтвержденную впоследствии обнаружением ЦМВ в аутопсийном материале у 69%. У остальных 23% больных этой группы не выявлено какой-либо выраженной органной патологии, но при этом у них были отмечены повышение температуры тела (до 38—40°С), резкая слабость, значительное снижение массы тела. При дальнейшем наблюдении у этих пациентов через 1—2 мес развились ретинит, колит и пневмония ЦМВ-этиологии.
Ни у одного из пациентов с титром 1:100 (3+) манифестная ЦМВИ на момент обследования не была выявлена. В то же время, у 84% больных данной группы были зафиксированы длительная (более 14 дней) субфебрильная лихорадка, умеренное (на 10—15%) снижение массы тела, анорексия, слабость; у 57,8% пациентов титр ДНК ЦМВ в дальнейшем возрос до 1:1000 (4+), при этом регистрировали повышение температуры тела (выше 38,5°С), усиление слабости, дальнейшее снижение массы тела. У 42% пациентов через 1—6 мес (в среднем 3,8 мес с момента выявления ДНК ЦМВ в титре 1:100) развилась манифестная ЦМВИ.
У пациентов с более низкими титрами ДНК ЦМВ: 1:10 (среднее время наблюдения 8,7 мес) и 1:1 (среднее время наблюдения 17,5 мес) хориоретинит и другие формы манифеотной ЦМВИ не развились.
Полученные результаты показывают, что наличие ДНК ЦМВ в крови ВИЧ-инфицированных больных в титрах 4+ и 5+ может служить диагностическим маркером манифестной ЦМВИ и являться показанием к назначению специфической противовирусной терапии. Данная методика является недорогим, быстрым и стандартизованным методом оценки эффективности специфической противовирусной терапии у ВИЧ-инфицированных больных с манифестной ЦМВИ.
ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ КОРИ
Мальцева Н.Н., Видунова С.Я., Ершова И.Б., Московский НИИ вирусных препаратов, Луганский государственный медицинский университет.В последнее десятилетие, во много раз уменьшалась заболеваемость корью, однако не исключается возможность ежегодных вспышек этого заболевания со смертностью среди восприимчивых лиц, большую часть из которых составляют дети до 3 лет. Трудность диагностики, особенно стертых форм заболевания, создает определенные сложности для своевременного выявления больных, в результате чего изоляция источника возбудителя инфекции осуществляется с опозданием. В связи с этим актуальными остаются раннее выявление заболевания и разработка экспресс-метода диагностики кори.
Разработан метод иммуноферментного анализа для определения антител против вируса кори. Иммуноферментная тест-система предназначена для диагностики первичной текущей инфекции, вызванной вирусом кори, и основана на выявлении вирусспецифических IgG с низкой авидностью, образующихся в начале иммунного ответа при размножении вируса в организме и сохраняющихся в течение 1-1,5 мес от начала заболевания. Суть метода заключается в следующем. При инкубации тестируемых сывороток с адсорбированными антигенами вируса кори образуются иммунные комплексы. После промывания планшет в часть лунок добавляют раствор, который способствует удалению "ранних" IgG, отличающихся низкой авидностью. После внесения конъюгата контролировали его связывание с комплексом антиген-антитело с помощью раствора хромогена в присутствии перекиси водорода. Интенсивность окраски пропорциональна количеству антител к вирусу кори в образце. После остановки ферментативной реакции раствором серной кислоты измеряли оптическое поглощение окрашенного раствора с помощью спектрофотометра при длине волны 492 нм. На присутствие в испытуемой сыворотке вирусспецифических антител с низкой авидностью будет указывать существенное снижение интенсивности окрашивания по сравнению с необработанными лунками.
Для проведения анализа используется сыворотка крови в количестве 1 ,5 мл. Методика проведения эксперимента в предлагаемой тест-системе состоит в следующем.
- В лунки планшета вносят по 0,1 мл исследуемых и контрольных образцов сывороток и проводят инкубирование в течение 2 ч при температуре 37°С.
- Планшет отмывают, в четные ряды вносят по 0,2 мл на лунку раствора № 5, который способствует удалению низкоавидных антител.
- Планшет отмывают и вносят по 0,1 мл раствора конъюгата, проводят инкубирование в течение 1 ч при 37°С.
- Планшет отмывают и добавляют по 0,1 мл раствора хромогена, проводят инкубирование в течение 20 — 25 мин при 1 5 — 25°С.
- Пероксидазную реакцию останавливают путем внесения во все лунки по 0,05 мл раствора серной кислоты в концентрации 2,5 ммоль/л.
Индекс авидности (ИА) антител испытуемых сывороток рассчитывают (в %) по формуле:
ИА = ОП1 х 100/ОП2
где ОП1 — разность ОП в лунках с вирусным и контрольным антигенами после обработки раствором № 5; ОП2 — ОП в лунках с той же сывороткой, не обработанных раствором № 5.
Выявление в испытуемой сыворотке антител с индексом авидности ниже 30% указывает на свежую первичную инфекцию у обследованного пациента. Выявленный показатель авидности, равный или превышающий 40%, указывает на то, что в сыворотке содержатся анамнестические высоко-авидные антитела, свидетельствующие о инфекции в прошлом. Показатель авидности антител в интервале 31 — 39% может свидетельствовать о поздней стадии первичной инфекции или недавно перенесенной инфекции только при условии выявления антител в высокой концентрации.
Разработанная тест-система может использоваться для ранней диагностики кори. Ее преимуществами являются быстрота в постановке, низкая себестоимость и достаточная прогностическая эффективность.
ГРУППОВАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ В ОБЪЕКТАХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
В. В. Буянов, В. П. Никольская, В. А. Минаев. ГНЦ — государственный НИИ биологического приборостроения Минздрава РФ, Москва.Быстрое выявление группы возбудителей, к которой принадлежит микроорганизм, вызвавший вспышку заболеваний, необходимо для проведения соответствующего комплекса санитарно-гигиенических мероприятий по локализации и ликвидации природного инфекционного источника. Возможность отнесения микроорганизма к бактериальной, вегетативной или споровой форме, вирусно-риккетсиозной группе, токсинам или грибам определяет специфику не только применяемых дезинфекционных средств, но и методов профилактики и лечения, а также класс используемых лекарственных препаратов.
Разработанные в настоящее время методы и способы индикации микроорганизмов являются довольно громоздкими и требуют для своего осуществления дорогостоящей аппаратуры и высококвалифицированных кадров, требуют значительных (до нескольких суток) затрат времени.
В настоящее время в качестве простейших средств, для определения различных компонентов в объектах окружающей среды широкое применение получили тест-системы, основанные на постановке капельных колориметрических реакций, для которых в качестве подложек служат соответствующим образом модифицированные хроматографические материалы.
В государственный НИИ биологического приборостроения Минздрава РФ разработан комплект простейших индикаторных средств, обеспечивающих возможность частичной групповой индикации микроорганизмов. К комплекту предъявляются требования по обеспечению проведения одного анализа за время не более 60 мин при температуре окружающего воздуха от -20 до +30 °С. Кроме того, разработан и введен в состав комплекта набор реактивов, материалов и технических средств, для отбора и подготовки проб и проведения аналитических реакций.
В основе обнаружения микроорганизмов с помощью индикаторных средств, входящих в состав комплекта, используется капельный метод микроанализа. В связи с этим в состав комплекта входят индикаторные вещества, средства их хранения и дозирования и средства для обеспечения проведения реакций.
Исходя из необходимости обнаружения и групповой индикации, обеспечиваются определение дегидрогеназной и пероксидазной активностей, а также наличия неорганических фосфатов, которые являются характерными признаками присутствия и жизнедеятельности микроорганизмов.
Реакции индикации проводятся на полосках хроматографической бумаги, импрегнированной соответствующими реактивами. На каждую полоску наносят каплю смачивающего раствора, каплю анализируемой пробы и наблюдают аналитический (колориметрический) эффект.
Для стандартизации условий проведения реакций в состав комплекта введены реактивы проверки, которые в соответствующих концентрациях дают такой же аналитический эффект, как и при взаимодействии соответствующей группы микроорганизмов с индикаторными бумагами.
Интерн Военно-медицинской академии Р.А. Яновский
You are reading Диагностика и выявление возбудителей инфекционных заболеваний. Продолжение articles